Introducción
El espárrago (Asparagus officinalis
L.) es originario de la región oriental del
Mediterráneo y Asia menor (Meusel et al.,
1965), crece en climas templados y subtropicales y
es la única especie de su género cultivada como
hortaliza (Ornstrup, 1997).
Al igual que en otras especies dioicas, las plantas
pistiladas son homogaméticas (XX) y las plantas
estaminadas son heterogaméticas (XY) (Reuther, 1992).
La expresión del sexo se hereda como un
factor génico simple dominante para la masculinidad (Marks,
1979) por lo que las
plantas estaminadas son heterocigotas (Mm),
mientras que las
plantas pistiladas son homocigotas recesivas (mm).
La particular biología de la especie ha permitido
desarrollar un gran número de materiales que han sido
seleccionados por su alto rendimiento de acuerdo a las
diferentes condiciones climáticas y de suelo de las
áreas productoras, y a la demanda local de mercado (Reuther,
1992). Más recientemente se desarrollaron distintos
tipos de híbridos de variabilidad reducida respecto a
las poblaciones originales,
permitiendo explotar el fenómeno de heterosis (Cointry et al., 1993) y presentan
un rendimiento significativamente superior al de las
poblaciones de origen (Corriols y Thévenin, 1979).
Los primeros híbridos comerciales fueron híbridos dobles con elevada
variabilidad genética desarrollándose con posterioridad
híbridos clonales que presentan una mayor homogeneidad
al provenir de la hibridación de dos plantas selectas no
endocriadas que fueron clonadas por división de la
araña. Sin embargo, el mejoramiento del espárrago a
través de técnicas convencionales resulta un proceso
arduo que requiere muchos años, por lo cual, en las
últimos décadas, se han comenzado a desarrollar técnicas
biotecnológicas como auxiliares en los planes de
mejoramiento. Estas han permitido la obtención de
híbridos clonales entre plantas selectas multiplicadas
por cultivo in vitro (Corriols y Thévenin, 1979;
Doré, 1990)
dependiendo el éxito, de las características del
material utilizado como punto de partida.
El
desarrollo de híbridos simples F1, de gran
uniformidad en la producción, permiten explotar de una
manera más eficaz la heterosis, siendo necesario contar
con líneas puras.
En esta especie la obtención de líneas es dificultosa
debido a la dioecia de la especie por lo que el cultivo
in vitro de anteras puede ser utilizado como
método para la obtención de progenitores de los híbridos
F1. El éxito de esta metodología depende
tanto del estado fisiológico de plantas donadoras como
del estadío de desarrollo del polen cuando las anteras
son cultivadas y de la presencia o ausencia de
reguladores de crecimiento en el medio de cultivo (Sunderland
y Dunwell, 1977). En condiciones óptimas de las plantas
donadoras, los niveles de producción de plantas
haploides suelen ser superiores al 1-2 % del total
cultivado existiendo diferencias en la respuesta para
los distintos genotipos. El cultivo de anteras genera
dos tipos de plantas homocigotas viables: plantas
estaminadas (MM), que son fenotípicamente iguales a los
machos ordinarios pero su polen es sólo de genotipo M y
plantas homocigotas femeninas (mm). La frecuencia de
plantas macho y hembras regeneradas por cultivo de
anteras es aproximadamente 60 % de machos y 40 %
hembras (Falavigna y Sorresi 1983). Cuando la
duplicación de cromosomas de las plantas haploides no
ocurre espontáneamente en el estadío de callo, los
meristemas haploides pueden ser colocados en medios con
diferentes concentraciones de colchicina por unos pocos
días para permitir su desarrollo como plántula diploide
(Doré 1976). Dado que el espárrago reacciona
favorablemente al cultivo in vitro, la posibildad
de disponer de plantas haploides permitirá acelerar los
planes de mejoramiento.
El objetivo del presente trabajo fue identificar de un
grupo de
15
genotipos estaminados élites aquellos con mayor
capacidad de desarrollar plántulas a partir de anteras.
Materiales y Métodos
Como material experimental se utilizaron anteras provenientes de 15 genotipos
estaminados de plantas élites progenitoras de híbridos
clonales producidos por la Facultad de Ciencias Agrarias
de la UNR.(Tabla 1).
Los pimpollos florales se recolectaron durante los
meses de septiembre y octubre, con un tamaño de 1,5
a 2 mm (coincidente con el estado uninucleado de las
microsporas) y se mantuvieron en heladera durante
24 horas a 4°C.
Tabla
1: Porcentaje
de callos totales(CT) y embriogénicos
(CE), de vástagos y plantas de las diferentes
plantas élites evaluadas |
|
CT:
% callos totales CE: % callos embrionarios |
La
desinfección se efectuó por inmersión en etanol al
70 % seguido por 5 minutos en una solución de hipoclorito
de sodio al 3 % de cloro activo con posteriores lavados
de agua bidestilada estéril. Las anteras (8 explantos
por tubo) fueron cultivadas en tubos de vidrio de
150x10 mm conteniendo 8 ml de medio de cultivo solidificado
con agar al 5%. Se efectuaron 20 repeticiones lo que
totalizó una siembra de 160 anteras por cada genotipo.
La iniciación de callos fue realizada sobre el medio de
cultivo constituido por los macroelementos,
microelementos y vitaminas del medio Murashige y Skoog
(1962) (MS) suplementado con 2 mg.l-1 de
ácido naftalen-acético (ANA) y 1 mg.l-1 de
bencilaminopurina (BAP). El pH del medio fue ajustado a
5,9.
La
incubación se efectuó en oscuridad durante 6-8 semanas y
a una temperatura de 28±2°C
transfiriéndose luego a cámaras de crecimiento con a una
temperatura de 25±2°C
y un fotoperíodo 16 hs hasta la aparición de callos con
una intensidad lumínica de 50
µE.m-2.s-1. Se utilizó un diseño completamente
aleatorizado para la distribución de los tubos en las
cámaras.
La
respuesta androgenética medida como el total de callos
desarrollados en relación al total de anteras sembradas
fue evaluada por medio de la prueba de ji-cuadrado (Sokal
y Rohlf, 1976),. Para su regeneración los callos fueron
transferidos a un
medio de cultivo constituido por los macroelementos,
microelementos y vitaminas del medio Murashige y Skoog
(1962) (MS)
con 0,1
mg.l-1
de
ácido naftalenacético, 0,1
mg.l-1
de
cinetina y 0,65
mg.l-1
de
ancymidol y 5% de agar. Se evaluó la tasa de
regeneración (TR) medida como el número de vástagos
desarrollados en relación al total de anteras sembradas,
estimándose también la proporción de plantas enraizadas
(TE). Para conformar grupos homogéneos de genotipos en
función de la respuesta androgenética, de la capacidad
de formar callos blanco-amarillentos y verdes y de la TR,
se efectuó un análisis de agrupamiento (Joining Tree,
STATISTICA) (Stat Soft, 1993). Para el conteo
cromosómico se efectuó el examen citológico en ápices
radiculares de plántulas desarrolladas según la técnica
descripta por Tsay y Hsu (1985).
Resultados
Luego de 6-8 semanas de cultivo en oscuridad se
observó la formación de masas callosas a partir del
interior de las anteras. Se observaron
diferencias altamente significativas en la
respuesta androgenética
(c2=1026.9;
p<0.001) (Tabla1).
Luego de su transferencia a la luz se observó que
algunos callos se tornaron verdes con una velocidad de
crecimiento moderada; otros marrones con detención de
su crecimiento y otros permanecieron de un color
blanco/amarillento con una alta velocidad de
crecimiento.
El 32 % de los callos producidos presentaron una
coloración amarillenta con un comportamiento
diferencial de los genotipos (c2=402.6;
p<0.001), el 49,6 % verde y el resto marrones (Tabla
1).
Sólo
los callos amarillentos originaron plántulas en una
proporción del 29.1 % con diferencias entre los
materiales (c2=186.8; p<0.001) y con un porcentaje de enraizamiento del 82.1 %.
El análisis de agrupamiento de los genotipos permitió la conformación de
cuatro conjuntos con características diferenciales
(Tabla2).
Tabla
2: Valores
promedios correspondientes a los cuatro grupos
de genotipos conformados |
|
CT:
% callos totales CE: % callos embrionarios |
Grupo I (G1): formado por aquellos genotipos (700 y 894) con
elevada capacidad androgenética y de formación de
callos blanco-amarillentos (embriogénicos), bajo
porcentaje de callos verdes y los valores más elevados
de la tasa de regeneración.
Grupo II (G2): genotipos 461 y 664 con capacidad androgenética
intermedia al igual que en la capacidad de formación
de callos embriogénicos y verdes como así también en
la tasa de regeneración.
Grupo III (G3): materiales (581 y 693) con capacidad nula de
formación de callos embriogénicos y valores nulos de
tasa de regeneración pero con máxima capacidad
androgenética aún con callos verdes
Grupo IV (G4): plantas élites (207 y 611)
con baja capacidad androgenética con formación de
callos embriogénicos y valores nulos de tasas de
regeneración. (Gráfico 1).
Gráfico
1: Agrupamiento
de plantas donantes de anteras en función
de la capacidad de formar callos blanco-amarillentos
o verdes, capacidad de inducción y valores
de las tasas de regeneración |
|
|
Discusión
El
cultivo de anteras resultó ser hasta el momento el
método potencialmente más eficaz y accesible para
crear plantas doble haploides (Falavigna,1979) aunque
es necesario abordar dos serias limitaciones: su
fuerte dependencia genotípica y el escaso número de
plantas regeneradas.
Falavigna (1979) y Tsay y Hsu (1985), demostraron que
el genotipo influye tanto sobre la inducción de
androgenesis, sobre la tendencia a iniciar callo, como
así también sobre la capacidad del callo en regenerar
vástagos y en su habilidad para establecer la corona.
Estas afirmaciones concuerdan con nuestros resultados ya
que se observó que la respuesta androgenética, depende
fuertemente del genotipo ya que ciertos genotipos no
produjeron callos mientras otros lo hicieron con valores
de 94 % a partir de las anteras sembradas. Tsay y Hsu
(1986) y Quiao y Falavigna (1990) observaron también que
los porcentajes de formación de callos fluctuaban entre
0 % y 93 % de las anteras sembradas mientras entre el 1
y 31 % de los callos producían vástagos.
Debido
al hecho de existir genotipos con buenas aptitudes, el
análisis de agrupamiento en función de la respuesta
androgenética permitió conformar cuatro grupos de los
que el grupo 1 (genotipos 700 y 894) demostró ser
superior. El genotipo 700 permitió que el 39 % de las
anteras produjeran callos, de los cuales el 28 % fueron
embriogénicos. Estos resultados fueron similares a los
presentados por Wolyn y Feng (1993), quienes obtuvieron
un 45 % de callos, de los cuales el 30 % eran
embriogénicos. Sin embargo, Rotondo (1984) y Hsu et
al. (1988) observaron que menos del 2 % de las
anteras sembradas producían callos embriogénicos en los
mejores genotipos.
A
partir del genotipo 700 lograron obtenerse 11 plantas,
de las cuales el 81,8 % tuvieron raíces funcionales.
Asimismo, para el genotipo 894, el 77,6 % de las anteras
produjeron callos y el 40,5 % de ellos fueron
embriogénicos. A partir de este genotipo se obtuvieron
21 plantas, de las cuales el 95,2 % tuvieron raíces
funcionales.
El
grupo 2 (genotipos 461 y 664) presentó resultados menos
satisfactorios aunque también interesantes para los
fines de este trabajo. Los genotipos 461 y 664, se
caracterizaron por su capacidad intermedia de formación
de callos embriogénicos, baja capacidad de formación de
callos verdes, intermedia capacidad de inducción y
valores intermedios de TR. Para el genotipo 461, el 10 %
de las anteras produjeron callos, de los cuales el 5,8 %
eran embriogénicos y, a partir del mismo, se obtuvo una
sola planta pero sin raíces funcionales. Para el
genotipo 664, el 94,1 % de las anteras produjeron
callos, de los cuales el 17,8 % eran embriogénicos y se
obtuvieron seis plantas con un 50 % de enraizamiento.
Es un
prerrequisito esencial la presencia de una corona
funcional para transferir las plántulas enraizadas a
condiciones autotróficas con éxito. El ancymidol reduce
el tiempo necesario para producir plántulas. Yang y
Clore (1973) lograron tener plántulas repicables en 20
semanas utilizando un medio de cultivo sin ancymidol.
Chin (1982) logró reducir ese período a 8 semanas
incorporando ancymidol al medio de cultivo, logrando
asimismo el desarrollo de tallos y raíces más vigorosos
y suprimiendo la formación de callos. En este trabajo,
se obtuvieron vástagos en condiciones de ser
transferidos a tierra, por lo que la incorporación de
ancymidol al medio de cultivo resultó satisfactoria.
La
eficiencia del cultivo de anteras obtenida fue del 2 %
del total de anteras sembradas, teniendo en cuenta todos
los genotipos sembrados. Y se obtuvo una eficiencia del
7 % cuando se tuvieron en cuenta los resultados
arrojados por los genotipos 461, 664, 700 Y 894, los
cuales formaron parte de los dos grupos que respondieron
de mejor manera. Falavigna et al. (1990)
obtuvieron menos de 10 plantas por cada 100 anteras
cultivadas y menos del 10 % de las plantas fueron
haploides.
Los
resultados del conteo cromosómico en ápices radiculares
de plantas tomadas al azar de diferentes genotipos,
mostraron un porcentaje de haploidía y diploidía del 40
% y 60 %, respectivamente. El hecho de que el número
cromósomico sea diploide, no significa que el desarrollo
del callo no haya sido a partir de microsporas haploides.
Las plantas diploides obtenidas pueden haber provenido
de la duplicación cromosómica espontánea de las plantas
haploides en la fase de callo (Doré, 1976). Para
comprobar esta situación, deberían realizarse pruebas a
campo ya que, si apareciesen plantas pistiladas,
implicaría automáticamente que la planta provino de
microsporas y se duplicó durante el cultivo in vitro.
Si apareciesen plantas estaminadas, sería necesario
observar su descendencia al cruzadas con plantas
pistiladas. Si la descendencia fuera toda estaminada,
implicaría que la planta diploide es homocigótica,
mientras que si la descendencia estuviera constituida
por 50% de plantas estaminadas y 50% pistiladas, sería
indicativo de que la planta se desarrolló a partir de la
pared de la antera manteniendo el genotipo heterocigota.
Esto
nos permite concluir que mediante el cultivo in vitro
de anteras, es posible obtener plantas haploides y
dihaploides que pueden ser utilizadas para la producción
de híbridos, previa evaluación de sus capacidades
agronómicas existiendo una respuesta genotípica
diferencial.
Aunque el logro de homocigosidad rápida seguirá siendo
la ventaja principal del cultivo de anteras, la
homogeneidad y la estabilidad de los haploides
duplicados permitirán a los mejoradores hacer
selecciones más efectivas, especialmente respecto a
caracteres que experimentan intensamente el influjo del
ambiente o la dominancia genética.
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