Introducción
Aloysia triphylla
Palau, conocida con el nombre
vulgar de "Cedrón" o "Yerba
Luisa", es una planta
originaria de América del Sur
y constituye una de las especies más sobreexplotadas
en nuestro país.
Es una planta leñosa, arbustiva,
que puede alcanzar 1 m o más de altura, las hojas son
simples con un característico olor a limón
(Muñoz López de Bustamante,
1996). Las partes aéreas
contienen 0,2 a 1% de aceite esencial (Lamaison y
Petitjean, 1993), Stashenko et al. (2003)
determinaron que la familia de compuestos mayoritarios
es la de monoterpenos oxigenados, de los cuales el 60 %
correspondieron al citral. La acción farmacológica de
esta especie está relacionada fundamentalmente al aceite
esencial, habiéndose informado actividad
antiespasmódica, eupéptica, carminativa, antimicrobiana
y analgésica local, entre otras (Gupta, 1995; Dellacassa
y Bandoni, 2003). Es
oficial en la Farmacopea Nacional Argentina VI Ed.
(1978) y está incluida en el Código Alimentario
Argentino (1969).
Dada la dificultad de obtener semillas en nuestro clima,
el procedimiento normal de multiplicación es vegetativo
mediante esquejes, acodos o división de pies (Muñoz
López de Bustamante, 1996). La técnica de cultivo in
vitro es una alternativa potencial para la
conservación genotípica y permite además la obtención de
un número elevado de plantas en un espacio reducido y
bajo condiciones controladas que evitan la trasmisión de
enfermedades. Es una herramienta muy útil en programas
de mejoramiento, ya que tiene el potencial de producir
plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir
de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicación
Ilimitada (Olmos et al., 2004). Si bien se conoce que la
relación auxina/citocinina es un factor clave en el
control de la organogénesis in vitro (Skoog y
Miller, 1957), los resultados obtenidos al aplicar la
técnica no siempre son predecibles, haciendo imperiosa
la búsqueda empírica de las condiciones de cultivo más
favorables para la especie y el tipo de explanto
utilizado.
No se conocen estudios sobre
cultivos de tejidos con una posterior puesta a campo de
esta especie, por lo tanto, este trabajo se realizó con
la finalidad de estimular
la regeneración in vitro de plantas de
cedrón para proporcionar un
estricto control de la planta medicinal y solucionar el
problema de la escasez por sobreexplotación que sufre
esta especie en su hábitat natural.
Materiales y Métodos
Como fuente de explantos, se utilizaron plantas de A.
citriodora obtenidas en la zona de Rosario (Santa
Fe, Argentina), las mismas se mantuvieron en macetas con
tierra y en condiciones controladas en el invernadero de
la cátedra de Fisiología Vegetal de la Facultad de
Ciencias Agrarias (UNR).
Los explantos probados fueron trozos de hojas de 0,5 cm
y segmentos nodales de 0,5 a 1 cm de longitud, con 1, 2
o 3 yemas axilares. Para la desinfección, el material se
sumergió 15 minutos en una solución de hipoclorito de
sodio al 1,2% más una gota de Tween 20 y posteriormente
se lavó tres veces con agua destilada esterilizada, bajo
cámara de flujo laminar.
Los trozos de hojas se cultivaron en un medio de cultivo
compuesto por sales minerales y vitaminas de Murashige y
Skoog (1962) (MS) o en medio de igual composición
diluido 4 veces (MS/4)
y suplementados con distintas combinaciones de bencil
amino purina (BAP) (0; 0,1; 0,5; 1 y 2 mg.l-1)
y ácido naftalen acético (ANA) (0; 0,1; 0,5 y 1 mg.l-1).
Los segmentos nodales se implantaron en medio de cultivo
diluido a la mitad (MS/2)
o diluido 4 veces (MS/4)
y suplementado con distintas combinaciones (mg.l-1)
de BAP y ANA: 0:0 (medio 0), 0,1:0,1 (medio A), 0,5:0,1
(medio B), 0,1:0,5 (medio C) y 0,5:0,5 (medio D).
En todos los casos se adicionó a
los medios 3 %
de sacarosa y 0,7 % de agar.
El pH se ajustó a 5,6 con NaOH o HCl antes del agregado
del agar. Los medios se esterilizaron en autoclave a 120
˚C durante 20 minutos. Cada 15 días los cultivos fueron
transferidos a medio fresco.
La incubación se realizó en
cámara climatizada con una
temperatura de 25 ± 2 ºC, fotoperíodo de 16 horas y una
irradiancia de 60 µmol. m-2. s-1.
Se determinó el porcentaje de segmentos nodales que
dieron vástagos, el número promedio de vástagos por
explanto y se midió la longitud de los vástagos formados a los 7, 14, 21
y 28 días desde la brotación.
El
diseño estadístico utilizado fue un completamente
aleatorizado. Los tratamientos a comparar fueron los
distintos medios de cultivo, las variables estudiadas
fueron la longitud de los vástagos a los
7, 14, 21 y 28 días
y el número de vástagos a los 28 días desde la
implantación (a los datos se les aplicó la
transformación raíz cuadrada del número de vástagos). Se
hicieron 25 repeticiones por cada tratamiento.
Los resultados se sometieron al análisis de la variancia
y las comparaciones de las
medias entre tratamientos se hicieron mediante el test
de comparaciones múltiples de Duncan (p < 0,05). En el
caso de la longitud de los vástagos se aplicó un
análisis de regresión lineal para cada uno de los medios
de cultivo, utilizando los días como variables
regresoras y se compararon las pendientes de las rectas
de regresión.
Los brotes enraizados fueron transferidos a potes con
una mezcla de tierra y perlita de lava volcánica y se
mantuvieron cubiertos durante 15 días con polietileno
transparente para evitar pérdidas por deshidratación.
Resultados y Discusión
Durante el establecimiento in vitro, un 4 % de
los explantos foliares manifestó contaminación con
bacterias o con hongos. Los trozos de hojas sembrados en
medio de cultivo sin reguladores, permanecieron
inactivos y posteriormente murieron, mientras que en el
resto de los tratamientos se produjo un encrespamiento
de los explantos y luego la formación de callos. En el
único tratamiento donde hubo alguna respuesta de los
trozos de hojas fue en el medio con 2 mg.l-1
de BAP y 1 mg.l-1 de ANA, se observó en los
callos la diferenciación de raíces que se visualizó
recién a los 60 días de cultivo.
En este período de tiempo y con estas condiciones no se
produjo diferenciación de yemas.
La
respuesta de los segmentos nodales sembrados varió
según el medio de cultivo empleado, el mayor porcentaje
de explantos que originó vástagos a partir de las
yemas axilares, se presentó en los medios
MS/2, a diferencia de lo informado por Sansberro y
Mroginski (1995) que en A. polystachia obtuvieron
los mejores resultados en el medio diluido 4 veces.
El número promedio de vástagos por segmento nodal
fue significativamente superior en
MS/2
carente de reguladores (3,29) (Tabla 1) y fue en este
tratamiento donde se obtuvo un máximo de 6 vástagos/explanto,
este
resultado indica que en este medio de cultivo se incrementó
el número de vástagos/nudo con respecto al número
natural de esta especie.
Tabla 1: Número promedio
de vástagos por segmento nodal en medios
de cultivo MS/2 y MS/4 con distintas concentraciones
de BAP y ANA, en 28 días de cultivo. |
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Los
segmentos nodales manifestaron formación de callos
en la superficie de corte, a excepción de
los que permanecieron en
MS/2
sin reguladores, que fue el único medio en que no
hubo formación de callo basal. La rizogénesis directa
también fue observada por Sansberro y Mroginski (1995)
en A. polystachia.
En los medios
MS/2 y MS/4
con
reguladores, el 100 % de los explantos presentó callos
basales entre los 7 y los 14 días de cultivo.
En
MS/4
sin reguladores, el 8 % de los explantos presentaron
callos basales.
En los tratamientos MS/4 se manifestó un amarronamiento
progresivo que comenzó en las hojas basales.
La formación de raíces en
MS/2
con y sin reguladores se produjo a partir de los 14 días
de cultivo, en MS/4 sólo se observó enraizamiento en el
medio sin reguladores y en el mismo lapso de tiempo.
Se alcanzó un 76 % de explantos enraizados (3 raíces/
explanto en promedio) en MS/2 sin reguladores luego de 2
8 días de cultivo.
Los nuevos vástagos originados por la brotación de las
yemas axilares, se alargaron y a partir de los 28 días
de cultivo se empezaron a seccionar en segmentos uni y
multinodales y se los mantuvo en
MS/2
sin reguladores, donde enraizaron.
Se eligió este medio porque fue donde se obtuvieron las
mejores respuestas.
En coincidencia con Sansberro y Mroginski (1995), en
A. polystachia, se observó organogénesis directa de
raíces a partir de los vástagos, de esta manera las
conexiones vasculares son directas entre las raíces y
los vástagos sin previa formación de callos en la base
de las estacas. Una de las ventajas de la
división de los vástagos, es que ofrece la posibilidad
de aumentar la tasa de multiplicación con los sucesivos
subcultivos
(Olmos et al. 2004).
La longitud de los vástagos se determinó a los 7, 14, 21
y 28 días desde la brotación. Los resultados se
presentan en las figuras 1 y 2, donde puede observarse
que en el medio
MS/2 sin la adición de reguladores se logró un mayor
alargamiento de los vástagos en todas las fechas de
medición, las diferencias encontradas con respecto al
resto de los tratamientos fueron estadísticamente
significativas (Duncan p
<
0,05). El modelo de regresión lineal para los distintos
medios de cultivo resultó altamente significativo (p
<
0,0001) y la pendiente de la recta en el medio MS/2 0,
difirió significativamente con respecto a los demás
tratamientos.
Cuando las plantas alcanzaron más
3-4
cm de altura, se las extrajo de los tubos y luego de
lavadas sus raíces, se las plantó en contenedores
conteniendo tierra mezclada con perlita de lava
volcánica, se realizó una aclimatación gradual de las
mismas y se las transfirió a macetas de mayor tamaño a
medida que fueron creciendo. Las plantas prosperaron
exitosamente en tierra.
La organogénesis directa a partir de la regeneración
de yemas axilares asegura la estabilidad genética
de las plantas regeneradas y es útil cuando el objetivo
es la propagación clonal a gran escala.
Figura 1 y 2: Longitud promedio
de vástagos en medio MS/2 (0, A, B, C
y D) a los 7, 14, 21 y 28 días de cultivo. |
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Conclusiones
Los mejores resultados se obtuvieron con segmentos
nodales. La utilización del
medio MS diluido a
la mitad sin el agregado de
reguladores de crecimiento se estimuló la mayor
brotación y el enraizamiento de los brotes regenerados.
Se lograron plantas que crecieron exitosamente en suelo.
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