Summary

Introducción

Las bacterias fijadoras de N atmosférico (N₂) convierten este nutriente en  amonio mediante la acción de la enzima nitrogenasa. La soja (Glycine max (L.) Merr.) fija el N₂ en simbiosis mutualista con Bradyrhizobium japonicum y/o Sinorhizobium, La expresión de esta asociación es la presencia de órganos en las raíces, llamados nódulos dentro de los cuales se lleva a cabo la reducción del N₂. El cultivo se nutre del nitrógeno aportado por la Fijación Biológica del Nitrógeno (FBN) y del disponible existente en el suelo. La combinación de factores tales como las características del huésped, temperatura y humedad ambiental, las propiedades físico-químicas del suelo y la naturaleza de la población rizobiana naturalizada determinan la adecuada formación de nódulos, la eficiencia en la fijación del nitrógeno y la productividad del cultivo (González et al, 1997).

La FBN puede aportar entre el 25 al 90% del nitrógeno necesario para el desarrollo del cultivo, pero esto sólo puede concretarse cuando los factores ambientales no actúan como limitantes  (González et al, 1997;  Perticari et al, 2003; Perticari, 2005). El uso de especies capaces de nodular vigorosamente y de fijar el nitrógeno eficientemente, combinado con estrategias agronómicas simples, permitirán obtener altos rendimientos y contribuir a las reservas nitrogenadas del suelo (Brockwell, 1995; Perticari et al, 2003).

El mayor éxito en cuanto a la implementación de prácticas agrícolas sustentables vinculadas con la FBN ha sido sin lugar a dudas el desarrollo de los inoculantes para leguminosas, a base de cepas rizobianas. Los inoculantes son productos biológicos desarrollados para agregar artificialmente sobre la semilla, rizobios seleccionados por su especificidad, infectividad (capacidad de formar nódulos) y efectividad (capacidad de fijar N₂). En la década del ´70, nuestros suelos carecían de cepas de Bradyrhizobium japonicum y fue necesaria la incorporación de estas bacterias mediante la inoculación. Los efectos en los rendimientos del cultivo fueron evidentes y esto permitió una rápida adopción de esta tecnología por parte de los productores. La reinoculación anual llevó al establecimiento  en los suelos de poblaciones de rizobios naturalizadas provenientes de las cepas de los inoculantes, esto genera la competencia en la formación de los nódulos entre las cepas introducidas con el inoculante y las presentes en el suelo, ocupando estas últimas la mayor proporción de los nódulos  (Perticari  et a , 2003).

Según Brockwell (1995), en suelos con niveles medios de rizobios naturalizados, 10 a 10³ rizobios g^-1 de  suelo, la competencia entre los rizobios introducidos con el inoculante y los presentes naturalmente en el suelo, puede resultar de interés, especialmente si la población naturalizada es pobremente efectiva en la fijación del N₂. Con valores mayores de población naturalizada, el fenómeno de competencia por la ocupación de los nódulos es muy grande, lo que trae como consecuencia menores beneficios con la inoculación.

En nuestro país, los rizobios naturalizados, constituyen una población variable según la zona, que fluctúa entre 10² a 10⁵ rizobios g suelo ^-1 .Estudios realizados por IMYZA -INTA Castelar donde se evaluó la capacidad simbiótica de cepas aisladas de diferentes suelos, determinaron que la gran mayoría presenta buena capacidad de nodulación, pero mediana capacidad para la fijación del N₂  (González et al, 1997).

La práctica de la inoculación de semillas con productos de alta calidad comercial y técnicas de inoculación apropiadas, en las áreas sojeras nuevas, sin población naturalizada instalada y si no hay limitaciones nutricionales e hídricas, permitirá aumentar los rendimientos en valores promedios mínimos del 60%. En suelos "sojeros" con poblaciones naturalizadas de 10² a 10⁵  rizobios g^-1 suelo, la respuesta en el rendimiento suele ser nula o muy baja. No obstante, aún con incrementos de rendimientos mínimos esperados, del 5 al 10%, la práctica de la inoculación permite el "ahorro" del N mineral del suelo frente a un cultivo tan extractivo como la soja; mejorar  la calidad  del grano a través de una mayor concentración de proteínas y contribuir a una economía anual en el uso de fertilizantes nitrogenados (Hungría, 2006; Perticari et al, 2003). 

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el comportamiento de distintos inoculantes para soja y de la población de rizobios naturalizados del suelo, sobre la nodulación y parámetros de crecimiento y rendimiento,  en dos localidades del sur de la provincia de Santa Fe.

Materiales y Métodos

Las evaluaciones se realizaron en laboratorio (I) y en invernáculo (II) en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Rosario  y a campo (III), en las localidades de Cañada de Gómez y Clason, provincia de Santa Fe.

Los tratamientos fueron: cuatro inoculantes comerciales de marca reconocida (I1, I2, I3, I4); un producto conteniendo la cepa E109 (I5)  del IMYZA - INTA Castelar recomendada para la formulación de inoculantes y el  suelo con población naturalizada como testigo o control.

I. En laboratorio:

Recuento de rizobios viables: refiere al número de bacterias rizobianas vivas por unidad de producto. La siembra de los inoculantes se realizó en medio de cultivo ALM (manitol, 10g; extracto de levadura, 0.5g; K₂HPO_4, 0.5g_;  MgSO₄.7H₂O, 0.2g; NaCl, 0.1g; FeCl_3..6H₂O; 1 gota de una solución al 10%; SO₄Mn, 1 gota de una solución al 10%; agar-agar, 15g; rojo congo, 5ml solución stock (0.5g en 200 ml de agua destilada) y agua destilada, 1000ml). Se sembraron diluciones seriadas del inoculante, por triplicado en placa y por la técnica de extensión en superficie. Se incubó a 28ºC. El recuento se realizó a los 10 días después de la siembra. Para considerar la aptitud de los productos evaluados se tomó como parámetro de referencia  los fijados en la Resolución Nº 310/1994 del SENASA  que establece  que ". los inoculantes deben contener no menos de 1000 millones (10⁹) de rizobios por g o ml de producto a la fecha de elaboración y no menos de 100 millones (10⁸) por g o ml a la fecha de vencimiento. "

II: En invernáculo:

II.1.Evaluación de la infectividad por el porcentaje de plántulas noduladas.

Se inocularon las semillas según dosis recomendada por el fabricante y se sembraron 30 repeticiones por tratamiento en recipientes con vermiculita estéril como sustrato. Las plantas se regaron con solución nutritiva libre de nitrógeno y se mantuvieron  bajo condiciones controladas de luz, temperatura y humedad. Se descalzaron las plántulas y  se contaron los nódulos presentes. Se consideró apto aquel inoculante que a los 20 días de la emergencia presentó más del 80% de las plántulas de soja con 3 o más nódulos en la parte superior de las raíces (Resolución Nº 310/1994 del SENASA)

II.2. Evaluación del comportamiento de los inoculantes frente a la población naturalizada del suelo.

Se condujeron 10 plantas en macetas, con suelo de la parcela testigo proveniente de la localidad de Cañada de Gómez. Presentaba una población naturalizada semejante a la de Clason (10⁵  rizobios g^-1  de suelo), pero condiciones químicas de suelo más limitantes para la FBN: 103 ppm de NO₃ y 18ppm de P.

Esta experiencia tuvo una duración de 3 meses en condiciones controladas de luz, temperatura y riego y las plantas se cosecharon en estado R5.5 (Fehr y Caviness, 1977). Los tratamientos fueron dos inoculantes comerciales (I1, I2), la cepa testigo e 109 (I5) y el testigo o control sin inocular.

Como indicadores de efectividad se determinó: Número (Nº) total de nódulos por planta (NTN); N° de nódulos en raíz principal (RP) y raíces secundarias (RS); peso seco de parte aérea de la planta (g); peso seco de vaina (g); peso seco total de la parte aérea de la planta (g) y Nitrógeno total (%) (Bremner y Mulvaney, 1882).

III. Ensayo a campo:

Estos ensayos se llevaron a cabo en lotes de productores en las localidades de Cañada de Gómez y Clason, Santa Fe. La Tabla 1 muestra la caracterización de los sitios experimentales de los ensayos a campo.

Tabla 1. Caracterización del ambiente de los sitios experimentales: ubicación, tipo de suelo, historia agrícola y contenido de nutrientes a la siembra

La Figura 1 detalla las precipitaciones decádicas registradas durante el ciclo de la soja para cada localidad y la evapotranspiración del cultivo (ETC), calculada con los valores de evapotranspiración (ETP) de Oliveros (por Penman) multiplicado por el correspondiente coeficiente de cultivo. Esto permite observar la intensidad de la demanda atmosférica del año y los períodos de sequía para las diferentes localidades.

Figura 1: Lluvias y consumo de agua del cultivo de soja , en Clason y Cañada de Gómez, Santa Fe.

Los cultivares de soja fueron A 6445 (GM VI) y A 5520 (GM V) en Cañada de Gómez y Clason respectivamente. La siembra se realizó en la primera semana de diciembre de 2003. El sistema de labranza fue siembra directa. El tamaño de parcela en Cañada de Gómez fue de 100 m de largo y 10 surcos de ancho y en Clason 250 m de largo y 7 surcos de ancho. En ambas localidades espaciados a 0, 70 m.

Los tratamientos fueron los descriptos en el ensayo en invernáculo para  la evaluación del comportamiento de los inoculantes frente a la población naturalizada del suelo. El diseño  fue en bloques completos al azar con cuatro repeticiones.

La inoculación se realizó a dosis de marbete, cumpliendo con las precauciones necesarias para lograr una inoculación exitosa, disminuyendo al mínimo las condiciones extremas que puedan perjudicar la viabilidad del rizobio y los riesgos de contaminación entre productos. Todos los inoculantes fueron mezclados con funguicida recomendados por las respectivas empresas. La siembra se efectuó inmediatamente después del agregado del inoculante y funguicida a la semilla.

En ambas localidades, los suelos son de buena aptitud agrícola con prolongada historia sojera. Ambos suelos contenían al momento de la siembra del ensayo una población naturalizada de 10⁵  rizobios g^-1  de suelo.

Para la evaluación de la nodulación en las plantas de los ensayos a campo se extrajeron 40 plantas por tratamiento, en R5.5, Se tomaron diferentes submuestras conteniendo la totalidad de las plantas consecutivas que abarca la pala, a una profundidad de 20 cm y descartando el primer  surco lateral y 3 m de cabecera para evitar el efecto bordura. Del total de submuestras se seleccionaron 10 plantas con sistema radicular completo. Se separó la parte aérea y el sistema radicular se trasladó al laboratorio en bolsas de polietileno y en heladera para el recuento de nódulos. 

Como indicadores de efectividad se determinó: Nº total de nódulos por planta, N° de nódulos en raíz principal (RP) y raíces secundarias (RS),  peso fresco y peso seco (g);  materia seca aérea total (g) (tallos + hojas + frutos) y contenido de nitrógeno (%) en tallos + hojas + frutos.

Se extrajeron de cada unidad experimental 4 muestras de 1m² de plantas para la evaluación del crecimiento del cultivo, rendimiento y sus componentes, contenido de N en tejidos y granos,  Nº de granos por m²  y peso de 1000 semillas, El rendimiento se expresó con el 13.5 % de humedad.

Resultados y Discusión

Recuento de rizobios viables y evaluación de la infectividad por el porcentaje de plántulas noduladas.

La Tabla 2 muestra la concentración estándar de rizobios por unidad de producto, expresada en unidades formadoras de colonias (ufc) g^-1 o ml ^-1 de inoculante. Los inoculantes evaluados cumplieron con la concentración de rizobios por unidad de producto para el período de validez, fijados por el SENASA.

Tabla 2. Concentración estándar de rizobios viables por unidad de producto, expresada en unidades formadoras de colonias (ufc) g-1 o ml -1 de inoculante.  

La calidad de un inoculante comercial puede ser evaluada por varias metodologías, incluyendo exámenes microscópicos, test de infección en plantas por el número más probable (NMP), tests inmunológicos y técnicas moleculares, entre otros. No obstante, la evaluación por el recuento en placa del número de rizobios viables es un índice apropiado para evaluar la potencialidad de un inoculante (Lupwayi et al, 2000).   Es necesario contar con un elevado número de células por unidad de producto para garantizar, mediante una inoculación adecuada, Una cantidad de  80.000 rizobios por semilla de soja de acuerdo a la Resolución 310/94 del SENASA, permitirá una nodulación  especialmente localizada en la zona del cuello de la planta y que a los 15 días de emergidas la mayoría de las plantas hayan nodulado (Perticari et al, 2003). No siempre un alto número de rizobios por unidad de producto, es suficiente para asegurar la calidad del inoculante, la reglamentación vigente fija además parámetros de infectividad por el porcentaje de plántulas noduladas.

Todos los inoculantes evaluados en este trabajo, cumplieron con los estándares exigidos por el SENASA para este parámetro. Esto es coincidente con lo informado por Perticari et al, 2003 acerca de que en la actualidad  el 80% de los productos comerciales presentan parámetros de calidad dentro de rangos internacionales, con alto número de bacterias g^-1 o ml ^-1 de producto.

Evaluación del comportamiento de los inoculantes frente a la población naturalizada del suelo, en el ensayo en invernáculo.

No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos evaluados en este ensayo, ni en el NTN, ni en RP y RS.  La relación RP/RS muestra que el número de nódulos en RP fue siempre menor que en RS en todos los tratamientos en el estado de planta R5.5 (Tabla 3).

Tabla 3: Evaluación de la nodulación en plantas crecidas en invernáculo: recuento de nódulos en raíz principal (RP), raíces secundarias (RS) y Nº   total de nódulos por planta (NTN). Relación en porcentaje del Nº de nódulos en RP y RS (RP/RS) por planta.

Respecto al peso de la parte aérea de la planta no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos. En el porcentaje de N en planta, los tratamientos I2 e I5  registraron valores superiores con respecto a I1 y al testigo. No obstante, esto no se tradujo en diferencias en el contenido de N en vainas que contenían semillas en pleno crecimiento (Tabla 4).

Tabla 4. Evaluación del comportamiento de los inoculantes frente a la población naturalizada del suelo, en el ensayo en invernáculo: Peso seco (g) y contenido de Nitrógeno (%) en el estado fenológico R5.5.

Ensayo a campo:

En Cañada de Gómez (Tabla 5), el Nº de nódulos en RP y el  NTN por planta  fue  mayor para los tratamientos I1 e I2, los demás inoculados registraron valores promedio iguales al testigo. Sólo el peso seco de nódulos en RS presentó diferencias significativas, siendo el testigo con población naturalizada el que presentó mayor peso seco, aunque había presentado  menor Nº de nódulos por planta.

Tabla 5. Evaluación de la nodulación por planta en el ensayo de Cañada de Gómez:: recuento de nódulos en raíz principal (RP), raíces secundarias (RS) y Nº  total de nódulos por planta (NTN). Peso fresco y Peso seco (g) de nódulos por planta en el estado fenológico R5.5.

En Clason (Tabla 6), no se observaron diferencias significativas entre tratamientos en el Nº de nódulos en RP. En Nº de nódulos en RS y NTN, los valores mayores correspondieron en general a los inoculados, siendo el testigo el que menor número presentó. El Nº de nódulos en RP fue notablemente menor a los registrados en raíces secundarias. Solamente se observaron diferencias significativas en peso fresco en RP, siendo el testigo el que menor peso registró. 

Tabla 6. Evaluación de la nodulación por planta en el ensayo de Clason: recuento de nódulos en raíz principal (RP), raíces secundarias (RS) y Nº  total de nódulos por planta (NTN). Peso fresco y Peso seco (g) de nódulos por planta en el estado fenológico R5.5.

En Clason el Nº de nódulos por planta registrado en el estadio R5.5 son coincidentes a lo informado por Perticari et al, 2003 que considera que una adecuada nodulación presenta en el estado reproductivo R5-R6 al menos 12 nódulos en RP y entre 40 y 50 nódulos por planta.  En la localidad de Cañada de Gómez, el promedio del NTN es algo inferior a lo considerado adecuado por dichos autores, registrándose valores entre 30 y 40 nódulos por planta. En cuanto al peso seco de nódulos por planta, en nuestros ensayos, en todos los tratamientos los valores se encuentran muy por debajo al óptimo, fijado por los mismos autores  en 800 mg por planta.

La bibliografía plantea que la nodulación en RP es una característica cualitativa que suele ser de utilidad para determinar la calidad de la nodulación y que los nódulos presentes en RP han sido formados por las cepas introducidas con el inoculante en las primeras etapas del cultivo, mientras que los de RS son colonizados por cepas naturalizadas y son mas numerosos, de menor tamaño y con menor actividad fijadora (Papakosta, 1992; Díaz Zorita et al, 1999, Fernandez Canigia, 2003). En nuestro estudio, los patrones de nodulación respondieron a los de un suelo con buena dotación de población naturalizada y son coincidentes con lo informado por otros autores para la región sojera núcleo (Toresani et al, 2006;; Ventimiglia et al, 2003; Díaz Zorita et al, 1999).  

El NTN promedio por planta fue mayor para Clason (56) que para Cañada de Gómez (34), atribuible a las diferencias en el contenido de nitratos en el suelo (Tabla 1). Altas concentraciones de nitratos inhiben el proceso de infección, el desarrollo de los nódulos y la expresión de la actividad nitrogenasa ya que la FBN es un proceso energéticamente muy costoso para la planta  (Gonzalez, 2006; Racca et al, 2005; Perticari et al, 2003).

Las Tablas 7 y 8 muestran los valores de crecimiento, rendimiento y sus componentes y el contenido de N en tejidos y granos de soja para ambas localidades. No se observaron diferencias en ninguna  de las variables analizadas. Si bien el cultivo, registró un buen crecimiento vegetativo con una intercepción del 95% de la radiación en R3 en todos los tratamientos (datos no mostrados), los rendimientos fueron bajos en relación a los promedios para la zona, atribuible a la ocurrencia de sequías intermitentes de diferente intensidad y duración durante todo el ciclo del cultivo. En Cañada de Gómez fue más intensa que en Clason para la etapa reproductiva. Si se analizan los resultados entre localidades, se observa un mayor contenido promedio de N en semilla en Cañada de Gómez (6,6%) con respecto a Clason (5,9%) esto se atribuye al bajo rendimiento y fundamentalmente al  bajo peso unitario de las semillas.

Tabla 7. Cañada de Gómez: Evaluación del crecimiento en Kg ha-1 de materia seca (MS), rendimiento (Kg ha-1 ) y sus componentes (Nº de semillas m-2   y peso de 1000 semillas (PMS))  y contenido de nitrógeno en tejido y en granos (%), en R5.5.

Tabla 8. Clason: Evaluación del crecimiento en Kg ha-1 de materia seca (MS), rendimiento (Kg ha-1 ) y sus componentes (Nº de semillas m-2   y peso de 1000 semillas (PMS))  y contenido de nitrógeno en tejido y en granos (%), en R5.5.

Una buena inoculación, aún con inoculantes de buena calidad no siempre resulta en un aumento demostrable en la nodulación y los rendimientos. Esta falta de respuesta es común cuando el suelo cuenta con una elevada población de rizobios infectivos o cuando el N disponible no es limitante (Lupwayi et al, 2000;  Giller et al, 1995).

Ante la falta de respuesta en los rendimiento en suelos con población establecida, existe una tendencia a suspender la inoculación. Estudios han demostrado que los rizobios que se naturalizan van perdiendo eficiencia en la fijación del N₂, pero mantienen una alta capacidad para formar nódulos. Por otra parte con incrementos mínimos del 5 al 10% en los rendimientos es una razón suficiente para inocular (Perticari et al, 2003). Otros autores consideran que no se puede generalizar el concepto que todas las cepas naturalizadas son ineficientes o han perdido atributos asociados a la FBN. No obstante no es prudente desaconsejar la inoculación, debido a que factores ambientales adversos como sequías o inundaciones o el uso excesivo de agroquímicos pueden disminuir el Nº de rizobios presentes el suelo  (Gonzalez, 2006). 

AGRADECIMIENTOS:

A la Ing Agr. Julia Capurro (AER Cañada del INTA)  y José María Mendez (AER Totoras del INTA) por haber colaborado en la siembra,  cuidados de los ensayo y en la cosecha de los mismos.

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