ACERCA DE PLATAFORMA:

La Plataforma Agrotecnológica Biomolecular es una estructura que busca satisfacer las demandas de instituciones y empresas (particularmente PYMES)  vinculadas a los diferentes eslabones del sector agroalimentario en relación a tecnologías biomoleculares. Así, la Facultad de Ciencias Agrarias de la UNR gana protagonismo en promover la innovación tecnológica mediante la oferta de su estructura edilicia, equipamiento y capacidad técnica.

Su funcionamiento está en concordancia con las primeras etapas del “pipeline” de la biotecnología de plantas (descubrimiento de genes, pruebas de concepto, desarrollo de cultivos modificados genéticamente, introgresión de caracteres en cultivares de interés agronómico, medición de la expresión de genes), además de la prestación de otros servicios como detección, cuantificación e identificación de (trans)genes en muestras biológicas y de alimentos. La capacitación y formación de personal en estas tecnologías también son un compromiso de la Plataforma.

Este proyecto surge a raíz de una Convocatoria D-TEC de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCYT) del Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva de la Nación, que facilitó la radicación del personal involucrado  en esta plataforma y el financiamiento del ajuste de las metodologías requeridas.

EQUIPO de TRABAJO:

Director: Dr. Hugo Permingeat
Co Director: Dr Juan Pablo Ortiz

  • Dra. Valeria Perotti
  • Dr. Eduardo Daniel Souza Canada
  • Ing. Agr. Luisina Monasterolo
  • Lic. Valeria Palmieri
  • Lic.  Andrea Martinatto
  • Lic. Alvaro Larran
  • Lic. Daniel Tuesca
  • Est. Albertina Gauna

CONTACTO:

agrobiotec@unr.edu.ar
Teléfono 0341-4970080
Campo Experimental Villarino
Facultad de Ciencias Agrarias – UNR.
S2125ZAA Zavalla – Santa Fe – ARGENTINA

ESTRUCTURA DE FUNCIONAMIENTO:

División en Rutinas

Rutinas de proteínas

Los servicios ofrecidos por este área de la Plataforma incluyen técnicas de proteómica actuales, adaptables a cada tipo de muestra en particular y objetivo experimental planteado.

Las mismas incluyen:

  • Purificación de proteínas de interés.
  • Electroforesis en condiciones desnaturalizantes y no-desnaturalizantes.
  • Técnicas inmunológicas, como Western blots, ELISA.
  • Análisis diferencial de proteomas (totales o parciales).
  • Expresión y purificación de proteínas recombinantes en sistemas procariotas y/o eucariotas.
  • Determinaciones cinéticas específicas.

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Rutinas de Ácidos nucleicos y bioinformática

Los servicios ofrecidos por este área de la Plataforma incluyen técnicas de genómica y transcriptómica actuales,  adaptables a cada tipo de muestra en particular y objetivo experimental planteado.

Las mismas incluyen:

  • Extracción de ADN genómico y ARN total.
  • Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Análisis cualitativo.
  • Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCR en tiempo real).
  • Electroforesis de ácidos nucleicos.
  • Clonado y subclonado en sistemas procariotas y/o eucariotas.
  • Asistencia para el análisis bioinformático.

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Rutina de cultivo in vitro y transformación genética de plantas

Los servicios ofrecidos por este área de la Plataforma incluyen técnicas de cultivo in vitro y transformación genética, adaptables a cada tipo de muestra en particular y objetivo experimental planteado.

Las mismas incluyen:

  • Multiplicación o propagación de especies a partir de diferentes explantos, especialmente para plantas con un carácter beneficioso o particular, de difícil multiplicación por otros métodos.
  • Clonado de plantas in vitro con caracteres nuevos, independiente de la estación de crecimiento.
  • Rescate de embriones.
  • Obtención de líneas doble haploides que permiten acelerar los tiempos de desarrollo de variedades.
  • Análisis fisiológicos en condiciones in vitro.
  • Modificación genética de plantas por método indirecto (mediada por Agrobacterium tumefaciens, Floral Dip en Arabidopsis) y método directo mediada por pistola de partículas (Biobalística).
  • Mutagénesis sitio dirigida.

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SERVICIOS:

CLONADO, EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS RECOMBINANTES EN BACTERIAS Y LEVADURAS

La tecnología del ADN recombinante es, sin duda, una poderosa herramienta para alcanzar objetivos concretos a nivel de producción de proteínas, tanto de interés industrial como con fines académicos.

Este servicio proporciona todos los pasos necesarios para la obtención de una proteína recombinante purificada; desde la reacción de PCR específica, a partir del tejido desde donde se quiere amplificar el ARNm, siguiendo con la secuenciación del producto y clonado en el vector de expresión adecuado, para finalizar con la inducción de la expresión en el sistema elegido (procariota o eucariota), y su purificación.

Todos los pasos son chequeados mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida, según corresponda, en condiciones desnaturalizantes. Esta secuencia de actividades constituye la optimización de la producción de proteínas a escala de laboratorio, proporcionando una base adecuada para planear la producción a escala piloto.

ANÁLISIS BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES VINCULADOS A LA CARACTERIZACIÓN DE FENOTIPOS DE INTERÉS AGRONÓMICO.

Este servicio comienza con ensayos de evaluación cuali y cuantitativa del fenotipo (determinación de la fenología y parámetros de producción y calidad del cultivo en particular, en condiciones normales de crecimiento y en presencia de diferentes tipos de estrés biótico y/o abiótico). Se realiza el análisis estadístico adecuado según el diseño experimental para poder establecer si existen diferencias significativas en cada variable testeada; y se emite el informe correspondiente.

En particular, ofrecemos el servicio de cuantificación de los niveles de resistencia a diferentes principios activos (herbicidas comerciales) de biotipos o plantas transgénicas resistentes versus el biotipo sensible. Esto es llevado a cabo mediante la estimación del índice de resistencia (IR), en condiciones in vivo (curvas de dosis-respuesta) e in vitro (estudios de cinética enzimática mediante métodos espectrofotométricos). El informe se completa con la evaluación de los mecanismos moleculares de la resistencia (clonado y secuenciación de los genes target y análisis bioinformático ad hoc).

MULTIPLICACIÓN Y REGENERACIÓN IN VITRO DE ESPECIES DE INTERÉS AGRONÓMICO

En la agricultura, las rutinas de cultivo in vitro de tejidos vegetales abarcan un número heterogéneo de métodos que posibilitan la obtención en forma aséptica de órganos, tejidos o células en un medio de composición química definida e incubados en condiciones ambientales controladas, permitiéndonos su multiplicación, su saneamiento así como la posibilidad de establecer programas de mejoramiento genético más rápidos que en los cultivos tradicionales, mediante técnicas biotecnológicas e ingeniería genética.

MODIFICACIÓN GENÉTICA VEGETAL DE CULTIVOS DE INTERÉS

Nuestra plataforma cuenta con la experiencia de transformar genéticamente especies de valor agronómico, con preponderancia en cereales. Para ello, contamos con el equipamiento necesario para llevar a cabo métodos de cultivo in vitro y de transferencia genética directa e indirecta, destacándose un acelerador de micropartículas para la transformación genética, campanas de flujo laminar y diferentes cámaras de cultivo que, en condiciones controladas, permiten llevar a cabo todas las fases, desde la obtención de plantas madres y el cultivo de explantos in vitro hasta la fase de rusticación ex vitro.

EVALUACIÓN TEMPRANA DE EVENTOS: ANÁLISIS MOLECULARES PARA LA DETECCIÓN Y EXPRESIÓN DE TRANSGENES

Este servicio proporciona los medios para confirmar la presencia y número de copias del transgen integrado al genoma de interés (mediante PCR o qPCR sobre ADN genómico); y la cuantificación de los niveles de expresión, tanto a nivel de ARNm (mediante qPCR) como a nivel de proteína (mediante electroforesis diferencial en condiciones desnaturalizantes y/o Western blot).

Estas actividades forman parte de la Fase III del Pipeline de la Biotecnología Vegetal, dado que incluyen el seguimiento y estudio de los transgenes en las progenies de los eventos en estudio.

ASESORAMIENTO Y CAPACITACIÓN A PERSONAL DE INSTITUCIONES PÚBLICAS Y PRIVADAS (GERENCIAL Y TÉCNICO)

La capacitación teórica y/o práctica que propone nuestra plataforma tiene por objetivo primordial satisfacer las necesidades de los interesados, por lo que los contenidos son totalmente adaptables y pactados de antemano con cada usuario. Apostamos a que la generación de nuevas vinculaciones con el sector productivo y/o académico nos acerquen colaboraciones con potenciales demandas de los servicios brindados.

PROYECTOS:

MECANISMOS DE RESISTENCIA A HERBICIDAS

Las malezas son especies vegetales que crecen de forma silvestre en una zona cultivada o controlada por el ser humano, como cultivos agrícolas o jardines. Desde la introducción de los herbicidas sintéticos a fines de los años ’40, esta práctica ha sido la principal (casi única) herramienta utilizada para el control de malezas a nivel mundial. Durante mucho tiempo, los herbicidas han sido un medio muy eficaz, económico y relativamente sencillo de intervención. Sin embargo, el uso continuo del mismo herbicida o el mismo mecanismo de acción (MOA, del inglés Modes Of Action) condujo inevitablemente a la selección de poblaciones resistentes de malezas.

Los mecanismos de resistencia a herbicidas descriptos a la fecha se pueden clasificar en dos tipos, según la base bioquímica que los sustenta: resistencia del sitio blanco de inhibición (target) y resistencia no blanco (no target). La resistencia del sitio blanco ocurre cuando se producen modificaciones en el sitio activo de la enzima que es inhibida por el herbicida, debido a que limitan el impacto biológico de la molécula a pesar de que ésta llegue al lugar de destino a una dosis letal. Contrariamente, la resistencia no blanco involucra mecanismos que minimizan la cantidad de herbicida activo que alcanza el lugar de destino y protegen a la planta contra daños colaterales causados por el químico.

Actualmente, la base de datos mundial de malezas resistentes a herbicidas; www.weedscience.com informa que existen 159 especies resistentes a inhibidores de ALS, 48 especies resistentes a inhibidores ACCasa y 35 especies resistentes a glifosato.

En nuestro país, el primer caso de resistencia a herbicidas se reportó en Amaranthus quitensis en campos cultivados con soja de las provincias de Santa Fe y Córdoba, hacia 1996. Esta especie, conocida como yuyo colorado, presentó resistencia cruzada a imazetapir y clorimurón-etil (inhibidores de ALS). Los casos más recientes de malezas resistentes a herbicidas son los de A. quitensis (en las provincias de Córdoba y Santa Fe), con resistencia múltiple a glifosato y a inhibidores ALS; los de Sorghum halepense, con resistencia a inhibidores de ACCasa en la provincia de Santa Fe; y los de la especie originaria de Estados Unidos, Amaranthus palmeri, resistente a inhibidores de ALS. Esta última especie fue introducida durante la campaña 2011-2012 en el sur-oeste de la provincia de Córdoba, y se sospecha que, además, sería resistente a glifosato.

El objetivo general de esta línea de investigación consiste en identificar las bases moleculares responsables del fenotipo de resistencia a herbicidas observado en diferentes biotipos de malezas hallados a campo, con la potencialidad que ello implica. Concretamente, si se logra identificar las bases de una nueva resistencia, se pretende utilizar esta información para transformar especies de interés agronómico, lo cual podría significar una alternativa para combatir una de las principales problemáticas de la agricultura actual.

En esta temática se enmarcan los siguientes proyectos de tesis doctorales:

  • Caracterización del mecanismo de resistencia a inhibidores ALS y glifosato en Amaranthus palmeri. (Lic. Valeria Palmieri).
  • Caracterización del mecanismo responsable de la resistencia a inhibidores de ACCasa en Sorghum  halepense. (Lic. Andrea Martinatto).
  • Expresión de un gen de resistencia a varias familias de inhibidores de la acetolactato sintasa en plantas transgénicas. (Lic. Álvaro Larran).

Antecedentes de estudios sobre malezas resistentes a herbicidas:

  • Moschetti A (2007). Clonado de genes de resistencia a herbicidas y construcción de vectores de expresión para la transformación de plantas. Tesis de grado de Licenciatura en Biotecnología
  • Romagnoli MV (2008). Caracterización de la resistencia de Amaranthus quitensis a inhibidores de la enzima Acetolactato Sintasa (ALS). Tesis de Maestría en Manejo y Conservación de Recursos Naturales
  • Kraiselburd I (2009). Construcción de vectores para la transformación genética de plantas y desarrollo de estrategias para la selección de transformantes. Tesis de grado de Licenciatura en Biotecnología
  • Romagnoli MV, Tuesca D y Permingeat HR (2013). Caracterización bioquímica y molecular de la Acetolactato sintasa (ALS) de 4 biotipos de Amaranthus quitensis tolerantes a herbicidas. Ecología Austral, 23(2): 119-125
  • Lorenzetti F (2015). Estudio de las bases bioquímicas y moleculares de la resistencia a herbicidas en malezas de importancia agronómica Tesis de grado de Licenciatura en Biotecnología

SECRETOMAS FÚNGICOS EN LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE DIFERENTES BIOMASAS VEGETALES

El aumento de los precios de los combustibles fósiles, sumado a la contaminación ambiental provocada tras su quema, ha disparado el interés por la producción de combustibles a partir de fuentes de energía renovables. Los “biocombustibles de segunda generación” son aquellos obtenidos a partir de una variedad de materias primas no alimentarias que incluyen biomasa de desecho, tallos de trigo, rastrojo de maíz, pastos perennes, plantas celulósicas. Las células que constituyen la biomasa lignocelulósica poseen una pared cuyos componentes (celulosa y hemicelulosa) son factibles de transformarse en alcohol a través de diversos procedimientos químicos y/o enzimáticos. Sin embargo, la presencia de lignina perturba la obtención de bioetanol al impedir la exposición de los hidratos de carbono a la acción de las enzimas celulolíticas.

La viabilidad de la industria de etanol a partir de biomasas lignocelulósicas y su potencialidad depende del desarrollo de tecnologías que permitan atacar esta estructura compleja a un reducido costo. Una alternativa prometedora es el tratamiento fúngico de la materia prima. Los hongos de la podredumbre blanca son reconocidos como los microorganismos más activos capaces de degradar la lignina. Dentro de este grupo de organismos existe gran variabilidad con respecto a su capacidad de degradación y su especificidad, por lo que deben ser evaluados con cada sustrato de interés.

Spartina argentinesis y Panicum prionitis son dos especies C4 utilizadas como forrajeras en sistemas de cría bajo pastoreo extensivo. Estos espartillares soportan una baja carga animal y la producción de carne por unidad de superficie es muy baja, debiendo ser quemadas cuando disminuye su calidad forrajera (digestibilidad y palatabilidad), buscando el rebrote más tierno para la alimentación del ganado. Ambas especies presentan más del 60 % de la materia seca compuesta por azúcares fermentables, por lo que resultan altamente atractivas como sustratos para la producción de bioetanol.

Esta línea propone evaluar la eficiencia de diferentes pretratamientos (químicos y biológicos) en la liberación de azúcares fermentables sobre biomasa de espartillares para la obtención de bioetanol de segunda generación. Se pretende identificar y caracterizar las proteínas presentes en sobrenadantes fúngicos que participan en el proceso de ligninólisis y sacarificación de la biomasa, buscando futuras aplicaciones biotecnológicas de las mismas.

En esta temática se enmarca el siguiente proyecto de tesis de grado:

  • “Producción de bioetanol a partir de pastizales naturales” (estudiante de Lic. en Biotecnología Albertina Gauna).

Antecedentes de estudios relacionados con pretratamientos fúngicos

  • – Larran A. (2014) Tesis de grado de Licenciatura en Biotecnología. Evaluación de pretratamientos para la producción de bioetanol a partir de Spartina argentinensis: un proyecto tecnológico.
  • –  Larran, A., Jozami, E., Vicario, L., Feldman, S. R., Podestá, F. E., & Permingeat, H. R. (2015). “Evaluation of biological pretreatments to increase the efficiency of the saccharification process using Spartina argentinensis as a biomass resource” Bioresource technology, 194, 320-325.

OPTIMIZACIÓN DEL CULTIVO IN VITRO DE ESPECIES DE INTERÉS AGRONÓMICO

La ingeniería genética de plantas, mediante la transgénesis, ha contribuido de manera importante a la generación de resistencias (a herbicidas e insectos) en los cultivos de interés agronómico. Las plantas transgénicas son consideradas organismos vegetales genéticamente modificados (OVGMs); por consiguiente, esto implica altos costos de desregulación del producto, con períodos de ensayos prolongados para introducirlo en el mercado. Como consecuencia, surgió el desarrollo de nuevas tecnologías de mejoramiento por ingeniería genética, con la ventaja de que el producto obtenido podría estar excluido del alcance de la regulación de los OVGMs. Tal es el caso de la técnica de nucleasa sitio-dirigida. Estas tecnologías pueden ofrecer herramientas para atender varios objetivos del fitomejoramiento, entre los que se encuentran la resistencia a herbicidas y la calidad de aceites. El desarrollo exitoso de la manipulación genética de la soja dependerá de un protocolo eficiente de regeneración in vitro de la planta, de su adecuación a los sistemas de transformación y del sistema de selección.

La soja es considerada una especie recalcitrante al cultivo in vitro por ser la formación de cultivos embriogénicos extremadamente dependiente del genotipo. Aunque la mayoría de los genotipos analizados puedan regenerar plantas, lo hacen con baja frecuencia y presentan una calidad deficiente de cultivos. Además, desafortunadamente, los genotipos elite agronómicamente importantes son difíciles de manipular en condiciones in vitro. Una de las maneras de optimizar la regeneración de soja a través del cultivo embriogénico es el análisis de un gran número de nuevos cultivares con el fin de identificar el potencial embriogénico.

De este modo, la optimización de un sistema de regeneración in vitro de soja a partir de variedades con un cierto avance en los programas de mejoramiento resulta ineludible si se pretende abordar en un futuro el mejoramiento del cultivo mediante la aplicación de las nuevas tecnologías.

En esta temática se enmarca el siguiente proyecto de maestría:

  • “Desarrollo de técnicas de cultivo de tejidos para la regeneración de Glycine max” (Ing. Agrónoma Luisina Monasterolo).

Antecedentes en cultivo in vitro y transformación genética de plantas

  • “Desarrollo de trigo transgénico con genes de tolerancia a estrés abiótico”. Convenio UNR/BIOCERES SA. 2006-2008.
  • Lucas Lieber. (2014). Tesis Doctoral: Estudios moleculares del sistema de fijación de nitrógeno de Streptomyces thermoautotrophicus y proteínas accesorias para su utilización en plantas.
  • Drew MacKellar, Lucas Lieber, Jeffrey S. Norman, Anthony Bolger, Cory Tobin, James W. Murray, Mehtap Oksaksin, Roger L. Chang, Tyler J. Ford, Peter Q. Nguyen, Jimmy Woodward, Hugo R. Permingeat, Neel S. Joshi, Pamela A. Silver, Bjorn Usadel, Alfred W. Rutherford, Maren L. Friesen, Jurgen Prell. (2016). Streptomyces thermoautotrophicus does not fix nitrogen. Scientific Reports 6, Article 20086: 1-12 (DOI: 10.1038/srep20086).
  • “Desarrollo de un evento transgénico de resistencia a múltiples herbicidas inhibidores de ALS para soja”. Proyecto ANR 1100/2013. Resolución ANPCYT 448/14. COOP. PROV. SERVICIOS AGRÍCOLAS “CRIADERO SANTA ROSA” LIMITADA (2015-2017)